北京协和医学院病原生物学研究所崔胜研究小组与杨威课题组最新研究结果揭示HCV种属特异性决定因素。研究结果于近日在FASEB Journal 在线发表。

导读
CD81是HCV入侵的必须受体，通过与HCV-E2包膜蛋白结合介导病毒入侵。北京协和医学院病原生物研究所的崔胜和杨威课题组通过合作发现不支持HCV感染物种的CD81胞外区中188和196位氨基酸之间存在特定的分子内相互作用（氢键或盐键），而这一结构特征在人类CD81中并不存在。晶体结构学和生物物理学研究表明，CD81的188-196氨基酸的分子内相互作用束缚了CD81胞外区固有的构象动态变化，而这种构象动态变化是与E2结合的决定因素之一。突变实验证明：一方面，在人类CD81中引入188-196氨基酸之间氢键或盐键可提高CD81胞外区的构象稳定性，削弱与E2的结合能力，降低HCVpp的入侵效率和HCVcc的感染效率。另一方面，在小鼠和非洲青猴CD81中仅引入F186残基既无法拯救其与E2的结合，又无法获得HCV的入侵和感染能力；只有破坏其原有的188-196氨基酸间相互作用，释放其固有的构象动态变化才能有效提高与E2的结合能力，获得HCVpp的入侵和HCVcc感染的能力。这些研究结果为阐明HCV高度严格的种属特异性机制提供了线索，为选择支持HCV感染的小动物模型提供了关键依据。

丙型肝炎病毒（HCV）是慢性肝病和肝癌的重要诱因之一。跟据世界卫生组织统计全球约有1.7亿HCV感染者。虽然一批新型抗HCV药物上市，表现出理想的治疗效果。然而，仅仅依靠药物，难以实现传染病疫情的控制。在一方面，抗病毒药物的长期使用不可避免诱导耐药株的出现。在另一方面，传染病的预防手段始终是根除疾病的关键。因此，HCV疫苗的研发仍亟待突破。

自HCV的分离和鉴定以来三十余年的时间里，疫苗的研发进展始终滞后。这由于人们对高度复杂的HCV入侵机制尚未完全了解；疫苗研发工作缺乏小动物模型。HCV的入侵和复制严格依赖一系列宿主细胞受体。至今发现，HCV至少利用4种受体入侵宿主细胞，其中包括clusterof differentiation 81 (CD81) ，scavenger receptor classBmember1, Claudin-1 和Occludin等。HCV的受体中CD81和Occludin均属于人类特异性受体。正是基于这些原因，HCV感染具有高度严格的种属特异性。

CD81蛋白是HCV入侵早期不可缺少的受体，属于典型的四次跨膜蛋白家族，由~236个氨基酸组成。CD81的功能区域包括高度保守的4个横穿细胞膜的α螺旋和与之相连的3个细胞内环及2个细胞外环。较大的细胞外环定义为“大胞外环”（CD81-LEL），相对较小的胞外环定义为“小胞外环”（CD81-SEL）。CD81-LEL和CD81-SEL共同形成CD81胞外区（ectodomain），介导了与多种蛋白因子的相互作用。CD81-LEL是人们了解最多，也是最重要的区域。正是这个区域直接介导了HCV入侵。HCV的包膜蛋白E2（HCV-E2）直接与CD81-LEL相互作用，二者结合的亲和力可达到纳摩尔（nanomolar）水平。

由上可知，揭示CD81与HCV-E2蛋白相互作用的机理是理解HCV种属特异性的关键科学问题。尽管人类CD81-LEL和HCV-E2和核心结构域高分辨率晶体结构的分别获得解析，二者的相互作用的结构基础仍然不明。主要难点在于介导CD81和HCV-E2相互作用的区域均属于构象高度可变区域。例如，在核磁共振结构生物学研究工作中，CD81-LEL中的D-helix并未维持晶体结构中发现的α螺旋结构，而是表现出动态变化的无序结构。HCV-E2和核心结构域的晶体结构中未能观察到与CD81-LEL相互作用的区段，暗示了这段区域的构象不稳定性。这些发现提示了CD81-LEL与E2的相互作用遵循了Fold-upon-Binding的原则，即二者的结合需要较大的蛋白质构象变化。

为了揭示CD81和HCV-E2相互作用的分子基础，崔胜研究小组首先解析了两个不支持HCV入侵的小鼠和非洲青猴的CD81-LEL（mCD81-LEL和agmCD81-LEL）的晶体结构，然后与人类CD81-LEL(hCD81-LEL)进行比对。晶体学结构表明，mCD81-LEL和agmCD81-LEL与hCD81-LEL的全局结构基本相同。经过深入分析，我们进而发现不支持HCV感染的CD81-LEL结构中存在一个特有的分子内相互作用，即在188和196位氨基酸之间形成了分子内氢键或盐碱。而这一结构特征在hCD81-LEL中是不存在的。在hCD81-LEL中，188和196位氨基酸均为带负电的谷氨酸和天冬氨酸，二者由于静电排斥无法形成相互作用。这一结构特征的差异恰恰影响了与HCV-E2蛋白结合的D-helix的构象变化。结构分析表明，188和196位氨基酸之间的相互作用力可将构象灵活的D-helix与相对稳定的E-helix连接起来，从而束缚了D-helix固有的构象变化。

为证明这一假说，研究人员采用了圆二色光谱分析。的确，mCD81-LEL和agmCD81-LEL在溶液中均表现出较hCD81-LEL更高的构象稳定性。当通过点突变在hCD81中引入188和196位氨基酸之间氢键或盐键，研究人员能够明显观察突变导致的CD81-LEL构象稳定性提升。为了寻找188和196氨基酸之间的相互作用是否与CD81介导的HCV入侵有关，崔胜研究组通过与杨威课题组合作制备了一系列CD81-LEL的突变体，测量了突变体与HCV-E2蛋白的结合能力。

结果显示：当在hCD81-LEL的188和196氨基酸之间引入氢键或盐键，可以不同程度的削弱CD81-LEL与HCV-E2之间的结合能力。以往的研究证明位于D-helix的F186氨基酸残基是hCD81与HCV-E2之间的结合的决定因素，这一结果进一步证明，仅依靠F186不足以支持HCV-E2的结合，D-helix的固有构象变化是另一个决定因素。

为进一步证明这一理论，研究人员还制备了一系列不支持HCV入侵的mCD81-LEL和agmCD81-LEL的突变体。他们发现仅仅引入F186突变无法拯救mCD81-LEL或agmCD81-LEL与HCV-E2的结合能力；只有破坏mCD81-LEL和agmCD81-LEL原有的188-196分子内氢键或盐键才能有效的拯救与HCV-E2的结合能力。最后，研究人员在细胞水平上研究了CD81中188和196氨基酸之间的相互作用是否能够影响HCV入侵和感染。通过与杨威课题组合作，崔胜研究组发现：在一方面，在hCD81中引入188-196分子内氢键或盐键时能够有效降低“HCV假病毒颗粒（HCVpp）”的入侵效率和“细胞培养感染性HCV病毒颗粒（HCVcc）”的感染效率。同样，但在不支持HCV感染的mCD81和agmCD81中引入F186无法拯救HCVpp的入侵或HCVcc的感染，只有同时破坏mCD81和agmCD81中原有的188-196分子内氢键或盐键的时候才能有效的拯救HCVpp的入侵效率和HCVcc的感染效率。

综上所述，这项研究发现了一个全新的HCV入侵种属特异性决定因素。CD81蛋白中氨基酸残基F186虽然是HCV入侵的必要条件之一但并不是充分条件；CD81-LEL的D-helix固有的构象动态变化是支持HCV入侵的另一个必要条件。D-helix的动态构象变化直接受到CD81中188-196分子内相互作用的控制；当存在188-196分子内相互作用时，D-helix的动态构象变化受到束缚，因而不利于与HCV-E2的结合以及HCV的入侵。相反，当破坏188-196分子内相互作用时，D-helix恢复原有的构象动态变化，因而有利于与HCV-E2的结合，支持HCV的入侵。

研究人员发现的HCV入侵种属特异性决定因素与以往的研究结果高度相符。例如，能支持HCV感染的黑猩猩和树鼩的CD81均不但具有F186残基，而且具有带负电的188谷氨酸和196天冬氨酸（不支持188-196氨基酸分子内相互作用）。相反，来自不支持HCV入侵物种的CD81序列中，要么缺少F186残基，要么存在188-196氨基酸分子内氢键或盐键。因此，这一发现可以作为选择HCV感染小动物模型的依据。例如，大鼠（Rattusnorvegicus）的CD81中虽然不具有F186残基，但具有带负电的188谷氨酸和196谷氨酸，无法形成相互作用。从这一点上考虑，大鼠CD81比非洲青猴和小鼠的CD81更接近人类CD81的性质，更易于改造成HCV感染的动物模型。

原文摘要：

An intramolecular bond at cluster of differentiation 81 ectodomain is important for hepatitis C virus entry

Hepatitis C virus (HCV) infection is one of the leading causes of chronic liver diseases; however, HCV vaccine remains unavailable to date. One main obstacle is the lack of an efficient small animal model. Cluster of differentiation 81 (CD81) is an essential entry coreceptor for HCV species specificity to human, though the underlying mechanisms are yet to be fully elucidated. We performed structural, biophysical, and virologic studies on HCV nonpermissive CD81s from mouse and African green monkey [mouse cluster of differentiation 81 (mCD81) and African green monkey cluster of differentiation 81 (agmCD81)] and compared with human cluster of differentiation 81 (hCD81). We discovered an intramolecular hydrogen bond (Gln188-Nε2-H: Glu196-Oε2, 2 Å, 124°) within the large extracellular loop (LEL) of mCD81 and a salt bridge (Lys188-Nζ: Asp196-Oδ2, 2.4 Å) within agmCD81-LEL between 188-196 residues. This structural feature is missing in hCD81. We demonstrated that the introduction of a single 188-196 bond to hCD81 impaired its binding affinity to HCV envelope glycoprotein 2 (HCV E2) and significantly decreased HCV pseudoviral particle (HCVpp) entry efficiency (4.92- to 8.42-fold) and cell culture-grown HCV (HCVcc) infectivity (4.55-fold), despite the availability of Phe186. For HCV nonpermissive CD81s, the introduction of Phe186 by Leu186F substitution alone was insufficient to confer HCV permissiveness. The disruption of the original 188-196 bond and Leu186F substitution were both required for potent binding to HCV E2 HCVpp entry efficiency and HCVcc infectivity. Our structural and biophysical analyses suggest that the intramolecular 188-196 bond restricts the intrinsic conformational dynamics of D-helix of CD81-LEL, which is essential for HCV entry, thus impairs HCV permissiveness. Our findings reveal a novel molecular determinant for HCV entry in addition to the well-characterized Phe186 and provide further guideline for selecting an HCV small animal model.—Yang, W., Zhang, M., Chi, X., Liu, X., Qin, B., Cui, S. An intramolecular bond at cluster of differentiation 81 ectodomain is important for hepatitis C virus entry.